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如何调试显微镜
发布者:顺华仪器 发布时间:2013/9/23 8:06:27 浏览:3634次 【字体:

【如何调试显微镜】

一???⊿显微镜照明光路系统的调剂:

为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明,在显微镜初次安装和调试时,就必须把照明光路系统调剂好,这是正确应用显微镜,并获得正确???⊿可*成果的重要手段和最基础的请求??。此外,正确控制照明光路系统的调剂,是应用显微镜过程中调换光源灯泡后所必经的步骤,也是在日常应用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段??。显微镜照明光路系统的调剂重要有以下4项内容:

1???⊿照明光源灯室在显微外的初步调剂

首先将灯室的外壳打开,压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中,安装时避免手指直接接触灯泡(可用柔软的布或纸隔住),以免灯泡上留有指纹等脏物,影响灯泡的应用寿命??。

把灯室摆在桌面上,接通电源后,用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔(标有“←→”),使灯丝投影在1-2m外的墙上,将灯丝成像调至清楚;然后调节灯的高低地位调节丝孔(标有“──”),使灯丝地位高低适当;再调节灯的左右地位调节螺丝孔(标有“──”),使灯丝左右地位合适??。

2???⊿光源发光体(灯丝)在显微镜内地位的检验和校订 目标是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域领域内,从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明,这是调剂库勒照明系统的前提条件??。需要的基础工具:对中望远镜购置显微镜时已配备??。

拔掉灯库内的毛玻璃套筒,把灯室装回显微镜上;

选用10×物镜,开亮光源程序找样品并调焦清楚,再换用40×物镜把样品调焦清楚(40×物镜可以看清灯丝的全貌);

把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大;

拔掉其中一个目镜,换上对中望远镜,抓住白色部分,另一手伸缩黑色接目镜,就可在视野中看到灯丝像;

如灯丝地位不合适,调“──”孔,把灯丝像沿程度方向调好,调“──”孔,把丝像沿垂直方向调好,直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像;

调剂完毕后,将毛玻璃套筒插回原位,拔掉对中望远镜,换回目镜作下一步调剂??。以上所述照明光源灯室在显微镜外的调剂和光源发光体在显微镜内地位的校验,只需在显微镜初次安装调试及调换灯泡时进行,平时应用显微镜时不能随便乱调乱动??。万一调乱时,可按上述步骤调回原状??。

3???⊿库勒照明(Kohler)系统的正确调剂 显微镜的正确调试,重要工作之一是照明光路系统的调剂,而其中的要害是库勒照明系统的调剂??。对于每一位应用显微镜的人员,特别是作显微照像的人员来说,应当对库勒照明系统的原理及其调剂步骤有必定的懂得和控制,才干充分施展显微镜应有的功效,拍出来的照片才干在效果上比较一致而又完善??。库勒照明系统的原理简略来说就是:光源发光体上任意一点发出的光,可以照明显微镜的视域领域,而光源发光体上每一点所发出的光汇集起来,在显微镜的视域中就实现了非常充分而又均匀的照明??。调剂库勒照明系统的目标,是为了使所视察的视域能获得均匀而又充分的照明,防止杂散光对照像系统造成影响或干扰,以免照像时在底片形成灰雾??。高调剂库勒照明系统的必要部件:视场光阑???⊿可进行合轴调剂的聚光镜系统??。

选用10×物镜和10×目镜;

把聚光镜前端透镜摆进光路中,孔径光阑调至适中的地位上(不大不小),再把聚光镜升到最顶的地位上,聚光镜转盘调至明视野“J”地位;

把视场光阑调至最小(0.1);

载物台上放上已封片的生物样品,开亮光源,调焦清楚;

视域中会涌现一个局部照明的区域或亮斑,这是视场光阑的含混像,在其中可以清楚地看到样品的细节;在它之外是较暗的视域,不必定能把样品的细节看得明确;

把聚光镜微微地向下调,使视野中的亮斑逐渐收小,慢慢变成一个清楚的多边形象,这便是视场光阑的清楚像;

一般情况下,多边形象并不在视域中央,需要调剂聚光镜的一对调中螺丝,把视场光阑多边形的像调至中央地位;

逐渐开大视场光阑,使多边形象成为视域的内接多边形,进一步核对调中的状态,如对中不够理想,持续微微调对中螺丝;

将视场光阑稍为再微微开大一些,使它的多边形象恰好消散在视域的边沿上,至此,库勒照明系统调剂完毕??。库勒照明系统调剂好以后,全部视域照明均匀,拍摄的显微照片明亮清楚,反差正常??。在日后应用过程中应特别注意: a. 视场光阑不可任意开大,但可随物镜倍数的增大而将视场光阑收小,随物镜倍数的减小而开大; b. 聚光镜的高低地位不准乱调,否则会损坏已调剂好的库勒照明系统; c. 应用10×以下物镜时要将聚光镜前端透镜摆出光路外,应用10×或10×以上物镜时要将前端透镜摆入光路中; d. 关于物镜倍数与视场光阑大小配合问题,在实际应用过程中,作为一般视察不必定要收小或开大视场光阑,但作显微照相时,为了避免杂散光线对照相系统的干扰,以便能拍摄到较完善的照片,则应在应用每一个倍数的物镜时,把视场光阑调节到正好消散于所视察的视域边上,这是比较繁复的工作,但又非做不可??。较为简便的方法是把与各个倍数物镜相对应的视场光阑事先调剂好,并作好记号,以后应用时根据记号直接调至相应的地位??。

4???⊿孔径光阑的正确应用 由于聚光镜的孔径光阑可以影响显微镜的分辨率,应用时应控制正确的应用方法??。过去由于对孔径光阑的认识不足,往往把它当作是调节视野亮度的工具??。虽然调节孔径光阑在必定程度上可以转变视野的亮度,但会直接影响成像的反差???⊿对照度及分辨率,在应用过程中应尽可能避免??。为了施展聚光镜孔径光阑的作用,以便在视察时,尤其在作显微照相时获得最佳分辨率,在每换用一个倍数的物镜时,在样品调焦清楚后,需要调节孔径光阑,使它的大小正好等于所用物镜数值孔径(物镜孔径像)的2/3 ??。 调剂方法是用对中望远镜对焦于视野中黑色相差环上,调节孔径光阑,可以看到一个多边形的孔径光阑像,然后调到等于物镜孔径像的2/3,即介于黑色相差环外与圆形视域内之间??。为方便起见,可把与各倍数物镜相对应的孔径光阑预先调剂好,并作好标记,以免每次应用都要重新调剂??。

二???⊿显微镜成像光路系统的调剂及显微镜检术概要:

显微镜成像光路系统的调剂,是根据不同显微镜检术的需要而进行的??。所谓显微镜检术(microscopy),概括而言就是以显微镜视察样品时所应用的照明方法,以及如何使样品所成的像能获得更良好反差的技巧与方法??。以下简述显微镜检术中已成熟的几种方法及对应的显微镜成像光路系统的调剂方法??。

1???⊿透射光明视野:

这是自显微镜创造以来最传统???⊿最广泛的利用方法??。基础部件: a. 物镜:任何物镜都可作明视野视察; b. 聚光镜:各种聚光镜均可,最好配有孔径光阑??。调剂方法:在上述显微镜的库勒照明系统调剂好后,即可利用明视野法??。实用领域:所有已染色的组织切片???⊿血液涂片等??。注意事项: a. 应用明视野方法视察时,必定要将库勒照明系统调剂好; b. 视场光阑不可任意开大,应用10×???⊿10×以下和10×以上物镜时,要将聚光镜前端透镜分辨摆事实出和摆进光路中; c. 不可用聚光镜的孔径光阑来调节视野的亮度,更不要乱调聚光镜的高低地位,否则,会降低显微镜的分辨率和损坏已调剂好的库勒照明系统; d. 作显微照相时,每换用一个倍数的物镜,就要调节聚光镜的孔径光阑,使它的大小正好等于所用物镜数值孔径的2/3 ??。

2???⊿透射光相差法:

这是现代显微镜检术中的一种反差加强法??。基础部件:相差物镜???⊿明视野与相差兼用的多用处聚光镜???⊿对中望远镜???⊿绿色滤光片??。

调剂方法:

a. 在库勒照明系统调剂好的基础上,用明视野方法把样品调焦清楚;

b. 把聚光镜转到Ph1对准转盘刻度线地位,选用10×相差物镜,换上待视察的透明样品;

c. 拔掉其中一个目镜,换上对中望远镜,并调焦于视野中的两个相差环上(物镜的黑色相差环和聚光镜的透光相差环);

d. 视野中的两个相差环不必定重合,调节聚光镜上的两个调节装置(调剂相差环左右地位的调节杆和调剂前后地位的摩擦式转钮),使透光环作前后左右移动而与黑环重合;

e. 调剂好后,换回视察用目镜,将绿色滤光片按入光路中,即可视察到样品的相差像;

f. 20×和40×物镜视察时,聚光镜应设在Ph2地位上,用100物镜时,聚光镜应设在Ph3地位上??。

实用领域:实用于视察透明???⊿未染色或不能染色的样品,如各种细胞???⊿活组织???⊿未染色或不染色的组织切片???⊿水生生物等??。

3???⊿微分干涉相衬法:

为了克服相差法视察时样品细节像周围伴随有光晕,会掩没掉本来应当看见的细节,以及样品或组织切片厚度请求相当薄,原则高低能厚于10?m等局限性,利用双光束干涉的原理设计子微分干涉相衬法??。

调剂方法:

a. 必须在库勒明系统已调好的基础上才干调好DIC方法;

b. 先用10×物镜,以明视野先断定好能把样品看清楚的物镜调焦地位;

c. 把起偏器(polarizer)摆入照明光路中,注意其取向应为东—西方向;

d. 把聚光镜转盘转到与10×物镜对应应用的地位上,即DIC 0.30.4

e. 在物镜后方或物镜转换器上插入10×物镜应用的DIC插片(DIC slider);

f. 把检偏器(analyser)插入成像光路中,注意其取向应为南—北方;

g. 换上待视察的透明样品,开亮光源把样品调焦清楚;

h. 调节DIC插片,使微分干涉相衬的像达到最佳效果,也就是浮雕效果最为明显;

i. 同时可调节聚光镜的孔径光阑,使反差的效果也达到最佳;

j. 然后再细微调样品的细节,可见样品中不同层面上的结构;

k. 如果把补色器(first order red retardation plate)插入,并同时调节DIC插片,可在视野中看到不断变更的壮丽色彩,红???⊿橙???⊿黄???⊿绿???⊿蓝???⊿紫???⊿粉红???⊿粉紫及金黄色都具有??。实用领域:透明或不能染色的组织切片,厚度可达100?m左右,造就中的活组织和活细胞???⊿小生生物等??。

4???⊿落射光激发的荧光法(incident-loght fluorescence Epi-FL):

简称为落射荧光法,是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差加强法??。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方,光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品,从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜视察??。该方法较简便,效率高,50W的光源强度比透射荧光法的250W还强??。荧光方法是利用波长较短的紫外光???⊿紫光???⊿蓝紫光???⊿蓝光及绿光等去激发样品,只要样品中含有可产生荧光的成分,它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光??。不同物质只能吸改特定波长的激发光,而释放的荧光也会有特定的波长,因而用作特异性的鉴定十分有效,如某些致病的细菌和螺旋体,受紫外光激发后能发出它们特有的荧光,很容易作出鉴定,这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法??。某些物质自身不会吸收激发光,或吸收后不能释放荧光,但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料,而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光,再释放出特定的荧光,从而间接地辨别出某种物质,这称为间接荧光法??。上述荧光方法广泛利用于医学???⊿生物学及工业的特异性研究和辨别上??。调剂方法:荧光显微镜或附有荧光部件的显微镜,调剂的方法大致雷同??。

  汞灯的安装:

a. 打开包装,取出汞灯将其警惕安装在上电极散热帽上,安装时注意手指不能直接接触灯管和散热帽的正面,汞灯的封气口要对向散热帽的左侧或右侧;

b. 把汞灯的上电极引张安装并固定在散热帽底面的小孔上,再把汞灯的下电极及上电极引线另一端,分辨安装在灯座上各自的插孔中并固定;

c. 锁紧散热片上的螺丝后,把汞灯连同灯座及散热帽警惕装入灯室中,锁紧相应的螺丝,再把灯座上的连线和插座插到汞灯电源后部专用的插座上??。

d. 详细的安装方法请参照有关阐明书??。

汞灯灯室在显微镜外的初步调剂:

a. 接通汞灯电源,让汞灯预热10-15min

b. 把汞灯灯室摆放在桌面上,让汞弧投影到2-3m外的墙上,划一条与灯室窗口中心线对地高度一样的程度线作为参考线;

c. 转动灯室调焦旋钮,使汞弧的像清楚地投影于墙上;

d. 分辨调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔,把汞弧的像其反射像调成并排且尽量*近,但不要重叠在一起??。

汞灯汞弧在显微镜内地位的检验:

a. 将汞灯照明光路系统中的视场光阑开到最大;

b. 把荧光滤光片组推到蓝光激发的地位上,以避免汞灯中的蓝光太刺眼;

c. 把视察的样品或一块载玻片放在物台上,盖上一张比盖玻片稍大且洁白的薄纸;

d. 取下一个物镜,使激发的蓝光经物镜转换器的空档照在白纸上,白纸上会有一蓝色的圆形照明区域,汞弧的像及其反射像都应当涌现在这区域的中央部位,否则,可调节灯室调焦旋钮至最清楚,然后分辨调节灯室外壳上的5个调节螺丝孔,直至汞弧的像及其反射像并排在照明区域的中央地位??。

e. 调好之后,把物镜装回去,通过目镜可见白纸被蓝光激发后发射出的黄绿色荧光;

f. 仔细调焦,可看清白纸的纤维;取去白纸,样品上的荧光细节隐约可见而很容易调焦清楚??。

汞灯应用注意事项 目前通常应用的为50W超高气压汞灯,灯管内通有一对钨电极和液态汞(室温下附在管壁上),未点燃时,管内气压很低,在灯管的两电极间施加电压角发点燃后,汞气化为汞蒸气形成汞弧而产生强光,温度升高,管内气压迅速升到10个大气压??。由于是高气压的气体放电,必须懂得其特征才干安全地应用汞灯??。

a. 汞灯接通电源后需要10-15min预热时间,汞才干充分汽化并形成汞弧,产生高亮度而稳固的激发光??。因此,视察前要提早通电;

b. 汞灯在应用过程中,不要随便开关汞灯的电源;

c. 关掉汞灯电源后,必须等候15-20min,待汞灯自燃冷却后才可再次接通电源,违背这一操作规定时,将会造成严重成果!由于汞灯内的汞蒸气未完整液化,汞蒸气内阻很小,一旦通电在两电极间施加电压,汞灯内形成壮大的电流,轻则烧断保险丝或烧毁汞灯电源中的扼流圈,重则汞灯爆炸,汞蒸气弥漫全部实验室,造成工作人员中毒,不仅丧失了汞灯,还会炸毁灯室内的集光-聚光部件??。

d. 汞灯的应用寿命一般只有300h,应用得当可达600h,应用寿命与开关的次数成反比,应集中一批样吕作2-3h的视察??。汞灯价格及昂贵,应爱护应用??。

e. 汞灯寿命终结的标记是点燃艰苦,灯管发黑??。

5暗视野法(dark field):

许多透明或半透明的样品,如细菌???⊿微生物???⊿细胞内的精致结构及结晶体的内含物等,在明视野显微镜中不容易看明确,如果采用暗视野法就可以大大进步样品的可视度??。以暗视野法所看到的是烘托在黑暗视野背景中发亮的样品轮廓及其细节??。广泛光学显微镜的最高分辨率为0.2?m,而暗视野显微镜虽然对样品的细节结构分辨不明确,但却可看到0.004?m以上微细颗粒的存在,即可以看到亚显微结构,特别合实用来视察微细的颗粒与细菌等??。调剂方法:暗视野法的重要必须部件是暗视野聚光镜??。应用时须先用明视野聚光镜把库勒照明系统调剂好??。换上暗视野聚光镜时,要把载玻片(样品)移开,将浸没油滴在聚光镜顶部,再把样品载玻片搁在物台上,浸没油便充填在两者之间,这种聚光镜须与装有可变光阑的100×油镜配用??。另一种中倍率干式暗视野聚光镜可与中倍率的物镜配用,这种聚光镜具有中央光挡,照明光只能透过光档与聚光镜边沿之间的透光环才干进入聚光镜内??。对于配备齐全的相差显微镜,与编号为Ph3物镜配用的相差聚光镜相差环,可以和 10×及10×以下的相差物镜配用而形成低倍率的暗视野效果??。

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